4月16日，国际权威学术期刊《Nature Communications》（IF=12.1）报道了我校生命科学学院乔云波副教授研究团队关于基因编辑工具优化和改良的最新研究进展《Structure-guided engineering of adenine base editor with minimized RNA off-targeting activity》。该研究工作中，研究人员基于腺嘌呤碱基编辑器与RNA的结合位点进行基因编辑工具改良，从而显著降低了腺嘌呤碱基编辑器的RNA脱靶效应。
CRISPR/Cas9系统包括核酸酶Cas9和向导RNA(sgRNA)，sgRNA与靶向位点通过碱基互补配对将Cas9-RNA复合体招募到靶向位点切割双链DNA，进而利用细胞的DNA修复机制实现靶向位点的基因编辑。在CRISPR/Cas9系统的基础上，科学家进一步发明了两类DNA碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBE；实现C•G到T•A的转变）；腺嘌呤碱基编辑器（ABE；实现A•T到G•C的转变）。碱基编辑器的基本原理是Cas9切口酶（nCas9，D10A）与脱氨酶融合，使得sgRNA范围内的胞嘧啶（脱氨酶为APOBEC1）或腺嘌呤(脱氨酶为细菌来源的TadA/TadA*二聚体)发生脱氨和DNA修复，从而实现精确的碱基编辑。
研究发现，两种碱基编辑器除了靶向DNA外，均因过表达效应产生了靶向RNA的编辑活性，因此诸多实验室开始优化碱基编辑器的编辑活性，以期获得高效DNA编辑活性和低效RNA编辑活性的编辑器，并且发表了一系列的研究论文。其中，胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的RNA脱靶效应已经得到了极大改观，而腺嘌呤碱基编辑器（ABE）的脱靶脱靶活性依然大量存在。
在此次研究工作中，研究人员发现之前用于评估ABE的RNA脱靶编辑活性的工具GATK HaplotypeCaller（用于检测生殖细胞突变）严重低估了被脱靶编辑的RNA的数量，从而提出利用GATK MuTect2（用于检测体细胞突变）评估RNA脱靶编辑更为合理。研究发现ABE诱导的RNA编辑主要发生在”UACGA” motif内，该结构为tRNA的核心结构域。鉴于ABE的脱氨酶TadA原本为RNA脱氨酶（识别的底物为RNA而非DNA），因此进化而来的TadA*虽然可对DNA进行脱氨，然而依然保留了RNA脱氨酶活性。研究人员根据已经发表的tRNA/TadA复合物的结构解析结果（图1A），设计了一系列包含可能可以破坏tRNA/TadA结合位点的ABE突变体，最终通过RNA编辑报告系统和细胞实验验证，发现TadA/TadA*的R153对其RNA脱氨酶活性至关重要，将该位点删除以后得到了理想中的突变体：RNA脱氨酶活性显著降低，而DNA脱氨酶活性基本保留（图1B）。该碱基编辑器优化方案也成功应用于近期发表的新型增强型腺嘌呤碱基编辑器ABE8e和ABE8s，亦可显著降低其RNA脱靶效应。
图1. 腺嘌呤碱基编辑器ABE的优化显著降低其RNA脱靶效应
综合来看，本研究基于发表的RNA/蛋白三维结构信息，设计基于CRISPR/Cas9的基因编辑工具的改良和优化策略，最终获得了去除负面特性、保留正面特性的改良型腺嘌呤碱基编辑器。该研究工作作为分子生物学工程化改造的典范，也为其它分子工具的改良和优化提供了新思路。
本研究由我校生命科学学院精准基因编辑工程中心乔云波副教授研究团队与上海科技大学黄行许教授、上海交通大学曹禹教授合作完成。黄行许教授和乔云波副教授为论文共同通讯作者，我校周建奎副教授、硕士研究生武素素、李丽平参与了该工作，广州大学为最后通讯作者单位。本研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省自然科学基金等的大力资助和支持。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-22519-z
（供稿：生命科学学院）
